2結(jié)果與討論

2.1生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選和鑒定

經(jīng)過血平板初篩得到25株菌株，表1是表面張力儀復(fù)篩結(jié)果。可以發(fā)現(xiàn)147號細(xì)菌發(fā)酵液的張力值明顯低于其他菌株，選擇147細(xì)菌作為目標(biāo)菌株。

觀察菌株培養(yǎng)特征及形態(tài)特征，可見菌體細(xì)長且長短不一，菌落較小，為扁平、濕潤的菌落。部分生理生化指標(biāo)如表2。經(jīng)16S rDNA測試并與GenBank中已登錄的核苷酸序列號進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)菌株147與Pseudomonas aeruginosa DSM50071同源性為99%，采用MEGA 5.10軟件NJ方法構(gòu)建147的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。結(jié)合生理生化特征結(jié)果，將菌株147鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），該菌株GenBank登錄號為KU921686。

表1細(xì)菌復(fù)篩結(jié)果

表2 147菌株的生理生化特性

2.2147細(xì)菌產(chǎn)生表面活性劑的物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定

通過薄層色譜分析顯示，苯酚-硫酸試劑有棕色斑點(diǎn)，加入茚三酮顯色劑則無明顯變化。這說明該菌株主要產(chǎn)糖脂類生物表面活性劑，不產(chǎn)生或者產(chǎn)生少量的脂肽類物質(zhì)。

將菌株147產(chǎn)物提純，紅外光譜儀（FT-IR）分析物質(zhì)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖2。該物質(zhì)在3701.72cm-1處有吸收峰，表明分子中有羥基存在；2 858.77～2 927.56 cm-1處的吸收峰表明存在糖類C-H的伸縮振動，1400～1200 cm-1處是C-H變角振動，1 734.39 cm-1處是C=O的雙鍵振動，而1 070.04 cm-1處為C-O-C鍵伸縮振動，因此該物質(zhì)中有一個五元環(huán)狀內(nèi)酯和糖苷鍵存在。由此進(jìn)一步證明該生物表面活性劑含糖脂類物質(zhì)。

發(fā)酵產(chǎn)物臨界膠束濃度是指分子在溶劑中締合形成膠束的最低濃度。臨界膠束濃度（Critical micelle0.005 concentration，CMC）可以作為表面活性劑表面活性的一種度量，CMC越小，改變表/界面性質(zhì)，起到增溶、乳化等所需的濃度就越低。從圖3可以看出：糖脂在0～300 mg·L-1時，表面張力值隨著糖脂濃度的升高而降低，且在300 mg·L-1時達(dá)到最小值；在300～500 mg·L-1時，表面張力值變化不大。可得發(fā)酵粗提產(chǎn)物的CMC為300 mg·L-1，明顯低于普通化學(xué)表面活性劑十二烷基磺酸鈉（SDS）的2200 mg·L-1，能在較低濃度下使用，因而在醫(yī)藥、食品、化工等行業(yè)具有廣闊應(yīng)用前景。

圖1 147菌株16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2 147菌株產(chǎn)的生物表面活性劑紅外光譜圖

圖3不同濃度生物表面活性劑溶液的表面張力

2.3147細(xì)菌發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1碳源的影響

碳源對細(xì)菌的生長與發(fā)酵產(chǎn)物量有重要影響。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）可在多種類型碳源下產(chǎn)生生物表面活性劑，包括甘油、乙醇、植物油等。由表3可知，以花生油為碳源，細(xì)菌發(fā)酵液的降低值為39.12 mN·m-1，明顯高于其他碳源類型；乳化值為34.17%，稍高于其他碳源，此時細(xì)菌生物量最大，糖脂含量最高，為0.30 g·L-1。雖然花生油作為碳源，能夠促進(jìn)菌株產(chǎn)生更多生物表面活性劑，但如果用于實(shí)際生產(chǎn)，成本相對較高，近年來一些研究者嘗試使用成本較低的工業(yè)副產(chǎn)物如糖蜜、廢潤滑油等作為碳源，發(fā)現(xiàn)也具有很好的促進(jìn)微生物產(chǎn)生生物表面活性劑的作用。因此，后期會考慮選擇用一些低成本碳源進(jìn)行發(fā)酵。

2.3.2氮源的影響

細(xì)胞表面的物質(zhì)合成需要氮源，氮源的種類會對細(xì)菌細(xì)胞的生長和發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量產(chǎn)生很大影響。由表4可以看出，不同氮源對細(xì)菌發(fā)酵過程中表面張力降低值的影響較小，可能與發(fā)酵液中的生物表面活性劑含量已經(jīng)達(dá)臨界膠束濃度（CMC）有關(guān)。當(dāng)?shù)礊榱蛩徜@時發(fā)酵液表面張力降低值最大，同時乳化性、細(xì)菌干重、糖脂含量均達(dá)到最大值。這與錢曉勇等研究結(jié)果一致，硫酸銨是促進(jìn)生物表面活性劑生成的較好氮源。

表3碳源對147細(xì)菌生長以及生物表面活性劑產(chǎn)量的影響

表4氮源對147細(xì)菌生長以及生物表面活性劑產(chǎn)量的影響

2.3.3碳氮比的影響

由表5可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)碳氮比在5以上時，表面張力降低值與乳化性變化不大，而細(xì)菌干重與生物表面活性劑含量卻明顯不同，說明當(dāng)碳氮比大于5時，該菌株生物表面活性劑產(chǎn)量已經(jīng)超過臨界膠束濃度。細(xì)菌干重在碳氮比為25時最大，為2.58±0.09 g·L-1，同時生物表面活性劑含量也達(dá)到最大，為1.74±0.01 g·L-1。這與Saimmai等研究結(jié)果一致，25是147菌株的最適生長碳氮比，此時細(xì)菌的生物量達(dá)到最高，生物表面活性劑產(chǎn)量也最高。