材料和方法

2.1. 酒樣

分析了 20 種單品種、白葡萄酒和紅葡萄酒。 他們包括來自白葡萄品種的樣本：Tsaousi（W1、W2、W3、W4、W5）、Robola（W6、W7、W8）、Lagorthi（W9、W10）、Sideritis（W11、W12）、Tourkopoula（W13） ) 和紅色 V. vinifera 葡萄品種：Augoustiatis (R1, R2)、Refosco Rosso (R3, R4)、Mavrodafni (R5, R6)、Vertzami (R7)，栽培于希臘西部。 相應(yīng)地，葡萄酒是使用相同的釀造協(xié)議生產(chǎn)的，白色或紅色。

2.2. 其他材料

牛血清白蛋白 (BSA) 購自 Acros Organics (NJ, USA)，L-(+)-酒石酸購自 Riedel-de Hae¨n (Seelze, Germany)，蘋果酸、乳酸和檸檬酸購自默克 (Darmstadt) ， 德國）。 KCl、NaCl、MgCl2.6H2O、CaCl2.2H2O、甘油，以及標(biāo)準(zhǔn)化合物 (+)-兒茶素、沒食子酸、乙醛、乙酸乙酯、甲醇、丙醇-1、甲基-2-丙醇-1、甲基- 2-丁醇-1、甲基-3-丁醇-1 和甲基-4-戊醇-2 來自 Sigma-Aldrich 化學(xué)公司（美國威斯康星州）。 緩沖溶液（pH 7.00 ± 0.02 和 pH 4.01 ± 0.02）來自 Mettler-Toledo。 無水乙醇、甲醇（99.8%，UV-IR-HPLC）、甲酸（98%）和鹽酸（37%）來自 Panreac Quimica SA（西班牙）、硝酸（65%）、磷酸（85%、 ACS-ISO)、硫酸 (95–97%)、氫氧化鈉、碘 (FIXANAL)、淀粉、EDTA 和磷酸二氫鉀來自 Riedel-de Haen (Seelze, Germany)。 考馬斯亮藍(lán) G250、(-)-表兒茶素、阿魏酸、咖啡酸和對香豆酸來自 Fluka (Buchs, Switzerland)。 花青素購自 Extrasynthese (Genay, France)。 葡萄籽和皮單寧（Tanipepin 和 Taniraisin）的商業(yè)提取物來自 Martin Vialattenologie（法國埃佩奈）。 HPLC 中使用的水由 MilliQ 水系統(tǒng)獲得，最小電阻為 18.2 MV cm。

2.3. 模型解決方案

制備濃度為 8% 至 16% (v/v) 的乙醇水溶液，以匹配葡萄酒范圍。 三組含有 BSA 蛋白或商業(yè)單寧的溶液制備在：(a) 水中，(b) 12% (v/v) 乙醇溶液和 (c) 模型葡萄酒溶液。 模型葡萄酒溶液由水/乙醇混合物 (88:12%, v/v) 和 2 g/L 酒石酸組成，pH 值通過添加 2 MNaOH 調(diào)節(jié)至 3.5。 研究的濃度為 0.025、0.100、0.250、0.500、0.750 和 1.000 克 BSA/L，以及 0.1、0.5、1.0、2.0 和 4.0 克丹尼皮平或丹寧菌素/L。

2.4. 方法

2.4.1. 表面張力測定

使用 Wilhelmy Constant Run 程序，通過 Wilhelmy 板法（自動 KSV Sigma_70 張力計(jì)，赫爾辛基，芬蘭）在 25 度下進(jìn)行表面張力測量。 結(jié)果表示為 mN/m，是三次重復(fù)分析的平均值。 獲得的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (%) 低于 5%。

2.4.2. 分析測定

基本釀酒參數(shù)：乙醇含量（% vol.）、可滴定酸度（g 酒石酸/L）和揮發(fā)性酸度（g 乙酸/L）、pH 值和還原糖（g/L）通過傅立葉變換確定紅外光譜 (FTIR) 技術(shù)，使用 FOSS 自動分析儀（WineScanTM FT120 Basic，丹麥）。 量化基于校準(zhǔn)曲線，該曲線使用從大量希臘品種葡萄酒分析中獲得的數(shù)據(jù)建立。 根據(jù)國際葡萄與葡萄酒組織 (1990) 快速方法測定總 SO2 (mg/L)。 所有分析均一式兩份進(jìn)行。 重復(fù)性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD %) 低于 10%。

總酚指數(shù)和單寧：總酚指數(shù)在 280 nm 處測定（Somers，1975；Sudraud，1958），而 Glories 方法（1978）用于測定單寧。 Shimadzu UV-1601 分光光度計(jì)（日本京都）結(jié)合 UVPC-1601 軟件用于所有 UV-vis 吸光度測量。 所有分析均一式兩份進(jìn)行。 重復(fù)性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD %) 低于 10%。

蛋白質(zhì)：布拉德福德方法（布拉德福德，1976 年）用于測定蛋白質(zhì)（Moreno-Arribas 等人，2002 年；Esteruelas 等人，2009 年）。 所有分析均一式兩份進(jìn)行。 重復(fù)性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD %) 低于 10%。

通過 HPLC 測定有機(jī)酸、陽離子和甘油：使用 Waters HPLC 機(jī)器，該機(jī)器由 Waters 510 泵和帶有 20 mL 定量環(huán)的 Rheodyne 7725i 型進(jìn)樣閥組成。 在分析之前，將樣品通過 0.45 Millipore 過濾器過濾并通過 Sep-Pak C18 小柱（Waters，美國）進(jìn)行純化。

酒石酸、蘋果酸、乳酸和檸檬酸的分離在 250 mm ? 4.6 毫米內(nèi)徑，5 毫米； PrevailTM Organic Acid column (Alltech Associates, Inc., Deerfield, USA) 根據(jù) OIV (1990)。 對于檢測，使用設(shè)置為 210 nm 的 Waters 996 光電二極管陣列檢測器。 洗脫系統(tǒng)由 25 mM KH2PO4 溶液（pH 2.5）組成； 流速為 1.5 mL/min，進(jìn)樣量為 20 mL。 四種有機(jī)酸的七點(diǎn)校準(zhǔn)曲線用于定量。

鉀、鈉、鎂和鈣的分離在 150 mm ? 3.9 毫米內(nèi)徑，5 毫米； IC-Pak Cation M/D 柱（Waters，美國），根據(jù) Theodoridis (1997) 的方法在等度條件下進(jìn)行。 檢測使用 Waters 431 電導(dǎo)檢測器。 洗脫系統(tǒng)由 0.1 mM EDTA 和 3 mM HNO3 溶液組成。 流速為 1 mL/min，進(jìn)樣體積為 20 mL。 四種陽離子的七點(diǎn)校準(zhǔn)曲線用于定量。

甘油的分離在 150 mm * 7.8 mm id, 7 mm 上進(jìn)行； 根據(jù) Zoecklein 等人所述的方法，IC-PakTM 離子排阻柱（Waters，美國）在 60 ℃下恒溫。 (1995)。 對于檢測，使用 Waters 410 示差折光檢測器。 洗脫系統(tǒng)由等度條件下的 0.005 M H2SO4 溶液組成。 流速為 0.5 mL/min，進(jìn)樣體積為 20 mL。 使用甘油標(biāo)準(zhǔn)溶液的七點(diǎn)校準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

所有分析均一式兩份進(jìn)行。 通過分析通常在葡萄酒中發(fā)現(xiàn)的兩種不同濃度的五種加標(biāo)模型葡萄酒溶液來評估方法的重復(fù)性。 所有化合物的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD %) 均低于 10%。

酚類化合物的 HPLC：根據(jù) Van De Casteele 等人的方法，使用帶有 PDA 檢測器的 HPLC 測定單個酚類化合物（兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸和花青素）的濃度. (1983)。 為了量化，酚類化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液以通常在葡萄酒中發(fā)現(xiàn)的濃度范圍內(nèi)的濃度使用。 結(jié)果表示為mg咖啡酸當(dāng)量/L。 所有分析均一式兩份進(jìn)行。 所有化合物的重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD %) 均低于 8%。

GC-FID 檢測揮發(fā)性化合物：將含有 50 mL 4-甲基-2-戊醇 (10 g/L) 水醇溶液作為內(nèi)標(biāo)的葡萄酒樣品 (5 mL) 直接注射到 Carlo Erba（GC 8000 系列）上配備火焰離子化檢測器 (EL 980) 和 50 m * 0.32 mm 內(nèi)徑、0.20 mm CPCarbowax 400 (Varian Inc., USA) 毛細(xì)管柱的氣相色譜儀。 烘箱溫度保持在50℃下10分鐘，編程到80℃下5℃/min，然后在80℃下保持10分鐘。 進(jìn)樣器和檢測器溫度分別為 200 和 230 ℃。 進(jìn)樣 (1 mL) 以分流模式 (150 mL/min) 完成。 氦氣是載氣 (2 mL/min, 90 kPa)。 揮發(fā)性化合物（乙醛、甲醇、乙酸乙酯、1-丙醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-1-丁醇和3-甲基-1-丁醇）通過比較保留時間與參考化合物。 為了量化，揮發(fā)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液以通常在葡萄酒中發(fā)現(xiàn)的濃度范圍內(nèi)的濃度使用（Bertrand，1968 年；Gkoulioti，2000 年）。 所有分析均一式兩份進(jìn)行。 通過分析通常在葡萄酒中發(fā)現(xiàn)的兩種不同濃度的五種加標(biāo)模型葡萄酒溶液來評估該方法的重復(fù)性。 獲得的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD %) 在 3.5% 和 8.2% 之間變化。

2.4.3. 統(tǒng)計(jì)分析

相關(guān)分析被用于檢驗(yàn)葡萄酒的表面張力和化學(xué)成分之間的線性關(guān)系。 為了獲得預(yù)測方程，使用了單一和多元回歸分析。 使用SPSS軟件，版本14.0進(jìn)行計(jì)算。

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