在滲透的作用下，原油中的烷烴類分子穿過細胞膜;再在降解酶的作用下，烷烴類分子被轉化為槐糖脂類生物表面活性劑。生物表面活性劑的產生有利于廢水中污油組分的乳化增溶，進而提高S.bombicola對石油烴的攝取效率。

圖3(a)、(b)為S.bombicola在油濃度為0.5%廢水中生長第1天和第10天時的TEM照片，圖3(c)為未添加O-13-1菌株的降解體系中土著菌群細胞的TEM照片。在降解第1天時，部分O-13-1菌株內部有透明液泡，并在降解第10天時逐漸變大，推測為所含原油中烷烴類物質凝聚而成。這與Singer等的研究結果基本一致，他們發現不動桿菌(Acinetobactersp.)HO1-N在降解正構烷烴后，HO1-N菌體細胞內部出現由烷烴構成的透明囊泡。而未添加O-13-1菌株的降解體系中，石油烴類物質難以通過被動運輸直接進入細胞內，故細胞內鮮有液泡產生。O-13-1菌體細胞內烷烴液滴的出現說明在槐糖脂類表面活性劑的作用下，烷烴從胞外到胞內的運輸過程大大增快，從而有利于胞內烴氧化酶的吸收利用。

圖3培養體系中添加球擬假絲酵母菌培養1d(a)、10d(b)和未添加球擬假絲酵母(c)細胞結構的變化

2.2菌株O-13-1強化降解石油烴產生物表面活性劑的結構鑒定

2.2.1菌株O-13-1強化降解含油廢水的表面張力

不同培養體系經10d降解后表面張力變化如表2所示。油濃度為0.8%、0.5%和0.3%的培養液表面張力分別為36.9、38.0和47.8 mN/m，相較于對照組分別降低了22.1、18.3和9.3 mN/m。其中，油濃度為0.8%和0.5%的培養體系的表面張力均小于槐糖脂溶液的臨界膠束濃度(CMC)所對應的最低表面張力(37.0 mN/m)。該結果說明了O-13-1菌株以采油廢水作為發酵底物產生的槐糖脂具有較高的應用效率。

目前，油田采出廢水主要用于回注油藏繼續進行注水采收。由于石油開采過程對回注水水質要求較高，污水對油藏適應性差且水驅采收率低下等原因，油田采出水循環利用效率較低。將采油廢水作為槐糖脂的發酵碳源，大量含有易生物降解、高表面活性的生物表面活性劑的回注水為三次采油提供了新的思路。

表2不同培養體系經10d降解后的廢水中的表面張力和槐糖脂產量

注:-:未檢測出。Nodetected.

2.2.2菌株O-13-1產表面活性劑結構初步鑒定

三組實驗發酵結束后均能利用乙酸乙酯提取出棕黃色物質，TLC可定性分析菌株O-13-1發酵得到的粗提產物。粗提產物與槐糖脂純品的TLC結果對比如圖4所示。由圖可知，粗提產物(1)顯棕黃色且與槐糖脂純品(2)顯色較深的點位置相同，說明粗提產物中有糖脂存在。同時，計算該點對應化合物的比移值(Rf)均為0.65左右，與文獻報道的槐糖脂內酯分子的Rf值相一致。據此，可初步判定粗提產物中存在槐糖脂。

圖4假絲酵母菌產表面活性劑薄層層析(TLC)其中(1)為粗提產物;(2)為槐糖脂純品標準物質。

2.2.3菌株O-13-1產表面活性劑HPLC-MS結構鑒定

圖5和圖6分別給出了假絲酵母菌O-13-1降解原油純化產物的HPLC-MS總離子流圖和保留時間為3.1min的組分質譜圖。可以看出，該純化物質含有11種酸型或內酯型槐糖脂同系物，其中保留時間為2.1、2.5 min為酸型槐糖脂，其余均為內酯型槐糖脂。這與HuYongmei等的研究成果基本相同，他們發現在以十六烷為碳源發酵生產槐糖脂時，內脂型槐糖脂在產物中占多數。在此培養體系槐糖脂的生物合成途徑中，主要步驟為細胞色素P450單加氧酶介導的烷烴氧化成脂肪醇，隨后通過衍生醇和醛的氧化進一步轉化為脂肪酸，因此，槐糖脂的結構與生產所用碳源有密切關系。

保留時間為3.1 min時色譜峰豐度最高。對該物質進行詳細分析，質荷比(m/z)645.32的碎片為單乙酰基取代的內酯型槐糖脂的分子離子峰，m/z 667.32為[M+Na]+峰，m/z 483.29為[M+H-C8H12O6]+峰，其中C8H12O6為乙酰基取代糖環。上述分析表明此物質為內酯型槐糖脂，具體名稱為:17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)-O-]十八二烯酸-1'，4″-內酯-6″乙酸酯。

另外，保留時間為6.5、6.9min的峰具有相同的主要離子碎片，二者可能互為同分異構體。已有文獻證明，在槐糖內脂的形成過程中，大多數脂肪酸通過ω-1位置連接，因此ω型槐糖脂含量較低。保留時間為6.5 min時色譜峰豐度比6.9 min較小，故保留時間為6.5 min對應組分為ω型槐糖脂，保留時間為6.9 min對應組分為ω-1型槐糖脂。利用質譜將槐糖脂純化物電離成具有不同質量的離子，得到不同保留時間的峰的離子信息，進而得到槐糖脂同系物的具體信息，見表3。綜上，可確定球擬假絲酵母菌O-13-1在降解采油廢水中石油烴組分的同時，分泌了生物表面活性劑槐糖脂。

圖5 O-13-1菌株產槐糖脂HPLC-MS總離子流圖

圖6保留時間3.1 min組分的質譜

表3球擬假絲酵母菌O-13-1所產槐糖脂同系物結構鑒定

3結論

(1)O-13-1菌株在原油濃度0.8%、0.5%和0.3%水平下中等碳數(C17—C28)組分生物降解率分別為7.0%~12.8%、17.9%~44.0%和4.5%~27.7%，結果表明O-13-1菌株在發酵過程中可利用采油廢水中原油的正構烷烴組分作為碳源生長。

(2)對發酵產物的鑒定及結構分析表明，O-13-1菌株利用采油廢水發酵所產表面活性劑中含有11種由乙酰基取代的內酯型和酸型槐糖脂同系物，其中2種為酸型槐糖脂，其余為內脂型。所產槐糖脂中含量最高的是17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)-O-]十八二烯酸-1'，4″-內酯-6″乙酸酯。在以采油廢水為碳源的發酵實驗中，原油濃度為0.8%、0.5%和0.3%的三組發酵液表面張力相較于空白組分別降低了37.5%、32.5%和16.3%。結果表明O-13-1菌株以采油廢水作為發酵底物產生的槐糖脂具有較高的應用效率，為采油廢水的回注處理及三次采油提供了新思路。