2.3 LOPs及其雙重乳液體外模擬吸收與轉運特性分析

2.3.1 LOPs及其雙重乳液對Caco-2細胞毒性分析

LOPs及其雙重乳液對Caco-2細胞的毒性，實驗結果見圖8。由圖8(a)可知，質量分數為0.25%、0.50%和3.00%的LOPs未能促進Caco-2細胞生長;當LOPs的質量分數超過6.00%時，細胞存活率極低，推測此質量分數的LOPs對細胞的滲透壓過高或過量的物質導致細胞死亡;當LOPs的質量分數為1.00%～2.50%時，細胞存活率(相對于無LOPs培養(yǎng)液對照組)均無顯著性差異，出現這類情況可能是由于，LOPs是含有各種氨基酸的多肽，添加了特定濃度的LOPs可能在一定程度上比常規(guī)細胞培養(yǎng)液促進了Caco-2的生長。根據預實驗結果，質量分數為2.00%的LOPs，在BL側可測得透過的LOPs含量在檢測的合適范圍，因此選擇質量分數為2.00%的LOPs進行后續(xù)實驗。由圖8(b)可知，LOPs的雙重乳液對Caco-2細胞的存活率的影響隨著乳液稀釋倍數的提高而不斷上升，這可能與雙重乳液中的乳化劑和大豆油對細胞具有一定的毒性有關。稀釋倍數過低的雙重乳液還可能對細胞產生高滲透作用，若LOPs雙重乳液的稀釋倍數過高，所含LOPs濃度過低，無法達到后續(xù)轉運實驗的條件。因此，綜合實驗結果，選用具有較高Caco-2細胞存活率的質量分數為2.00%的LOPs、100倍稀釋處理的LOPs雙重乳液進行后續(xù)的轉運實驗。

不同小寫字母表示各組數據間存在顯著差異(P<0.05)。

圖8 LOPs及LOPs雙重乳液對Caco-2細胞的毒性

2.3.2單層Caco-2細胞模型的驗證

2.3.2.1 TEER的測定

單層Caco-2細胞模型的完整性和致密性可以通過TEER進行評估。一般情況下，認為當單層細胞的TEER高于300Ω·cm2時，單層Caco-2細胞就可以用于進一步的實驗。圖9為不同初始密度的單層Caco-2細胞兩側的跨膜電阻隨培養(yǎng)時間的變化情況。由圖9可知，整個實驗周期，單層Caco-2細胞的初始接種密度對最終電阻的影響不大。前期細胞跨膜電阻變化緩慢，培養(yǎng)9 d后，跨膜電阻出現大幅度增長，在培養(yǎng)17 d后的電阻趨于穩(wěn)定，最后的電阻穩(wěn)定于375Ω·cm2附近，表明單層Caco-2細胞模型具有中度緊密度。

圖9 Caco-2細胞培養(yǎng)過程中的TEER

2.3.2.2堿性磷酸酶活性的測定

Caco-2細胞培養(yǎng)狀態(tài)及培養(yǎng)21 d后的堿性磷酸酶活性見圖10。由圖10(a)、(b)可以發(fā)現，培養(yǎng)3 d過程中，單層Caco-2細胞生長穩(wěn)定并均勻分布在Transwell上，貼壁情況良好。堿性磷酸酶AKP是小腸刷狀緣細胞的標志酶，其濃度代表了單層Caco-2細胞的極化和功能。觀察圖10(c)可知，培養(yǎng)21 d后，不同接種細胞密度在AP側的酶活性均高于BL側的酶活性，屬正常的細胞極化結果。初始密度為3×105個/mL的細胞AP側的AKP活性高于其他兩組，其BL側的AKP活性低于其他兩組，證明該組細胞分化情況較好。隨著細胞密度的增大，AP側與BP側活力的比值呈下降趨勢，說明初始細胞密度過大不利于細胞的分化。實驗結果表明，3種模型細胞均生長良好。

光學顯微鏡放大倍數為10×40;不同小寫字母表示AP側的組間數據存在顯著差異(P<0.05)，不同大寫字母表示BL側的組間數據存在顯著差異(P<0.05)。

圖10 Caco-2細胞的生長狀態(tài)及培養(yǎng)21 d后堿性磷酸酶的活性

2.3.2.3熒光素鈉透過率測定

標記物跨膜通量的測定也可以反映單層細胞膜的完整性，熒光素鈉標準吸收曲線及其在不同時間段的透過率見圖11。由圖11(a)的熒光素鈉的標準曲線方程中，代入BL側的吸光度，可計算出BL側的熒光素鈉質量，根據式(4)，即可得出不同時間段的熒光素鈉透過率[圖11(b)]。由圖11(b)可知，孵育2 h后，3個不同初始密度的細胞模型均對熒光素鈉具有一定的透過性。初始細胞密度為3×105個/mL的細胞模型對熒光素鈉的透過率相對較高，達到13.96%;初始AP側加入熒光素鈉的密度為20μg/mL，最終3種模型的熒光素鈉透過量均小于0.011 6μg/min，說明3種細胞模型單層膜的致密性能良好。

圖11熒光素鈉標準吸收曲線及其透過率

本實驗比較了3種初始細胞密度培養(yǎng)的細胞模型，3種模型的Caco-2細胞與細胞之間連接緊密，均具有良好的致密性和完整性，且已極性分化，表明已成功構建了單層Caco-2細胞模型，3種密度的細胞模型均可用于跨膜轉運吸收實驗。

2.3.3 LOPs及其雙乳液的轉運方式分析

藥物或營養(yǎng)物質通過單層Caco-2細胞模型的表觀滲透系數(Papp)與其體內吸收具有良好的相關性。現行國際物質運輸判斷標準:Papp值高于1×10-5 cm/s，吸收率在70%～100%，表明吸收良好;Papp值為1.0×10-6～1.0×10-5 cm/s，表現出吸收率為20%～70%，表明吸收適中;Papp值<1.0×10-6 cm/s，表現吸收率為0～20%，表明吸收不良。此外，Papp(BL-AP)與Papp(AP-BL)的比值(流出比)是藥物遞送行為的重要指標，如果比值小于0.5，則表明主要運輸方式是外流效應，比值在0.5～1.8，則說明主要轉運機制為被動擴散，比值大于1.8，說明主要運輸方式是主動運輸。根據本研究結果，我們將3種初始密度不同的單層Caco-2細胞模型均用于模擬吸收實驗，分析結果見圖12。由圖12(a)和圖12(b)可知，3種模型的Rapp值均高于1×10-5 cm/s，實驗結果表明，單層Caco-2細胞對LOPs及其雙重乳液的吸收良好。由圖12(c)可知，LOPs的流出比約為0.7，LOPs雙重乳液的流出比約為0.3，說明LOPs的轉運方式為被動擴散，LOPs雙重乳液的轉運機制為外流效應。然而，相比于LOPs的流出比，LOPs雙重乳液的流出比較小，說明雙重乳液對LOPs存在緩釋作用。

圖(a)和圖(b)中，不同大寫、小寫字母分別表示LOPs、LOPs雙重乳液的組間表觀滲透系數存在顯著差異(P<0.05)，圖(c)中，不同大寫、小寫字母分別表示LOPs、LOPs雙重乳液的組間流出比存在顯著差異(P<0.05)。

圖12 LOPs及其雙重乳液的滲透系數及流出比

3結論

本研究基于LOPs的界面性質，分析包封LOPs的W1/O/W2雙重乳液的體外模擬消化與吸收特性。研究結果表明，LOPs具有強親水性，但不具有降低油水間界面張力的能力，不具備乳化特性，需添加相應乳化劑以穩(wěn)定構建包封LOPs的W1/O/W2雙重乳液。體外模擬消化吸收實驗結果表明:LOPs雙重乳液經模擬口腔、胃消化及小腸消化，整個消化過程乳液粒徑呈現先增大后下降的趨勢，LOPs的包封率隨之下降;LOPs雙重乳液在胃部酸環(huán)境下發(fā)生聚集，而后到達腸道消化階段因雙重結構被小腸消化酶降解破裂釋放出大部分的LOPs，表明雙重乳液結構對LOPs具有一定的保護及緩釋作用。采用單層Caco-2細胞模型模擬體外吸收實驗，結果顯示:單層Caco-2細胞對LOPs及其雙重乳液的吸收特性良好，其中，LOPs以被動擴散的方式進行轉運，而LOPs雙重乳液的轉運方式為外流效應;LOPs雙重乳液的流出比小于LOPs的流出比，說明雙重乳液的包封作用對LOPs具有一定的延長吸收及長效作用。研究結果旨在為闡明包封水溶性生物活性肽的W1/O/W2型雙重乳液的消化、吸收及轉運機制提供一定參考。