β-乳球蛋白是乳清蛋白的主要成分，約占乳清蛋白總量的50%。β-乳球蛋白分子質量約為18.4 kDa，等電點為5.1～5.3，含有162個氨基酸殘基，具有良好的凝膠，起泡和乳化性能。在一定條件下，蛋白質單體經過構象改變，β-折疊增多并重新排列而發生聚集，這種聚集可以產生蛋白質納米纖維。蛋白質納米纖維是蛋白質在低pH值（例如pH 2.0～3.0）條件下進行熱處理得到的長直型自組裝產物，其直徑和長度尺寸分別在2～5 nm和200 nm～15μm范圍內，是具有較大長徑比的形狀各向異性材料。Dietler等通過原子力顯微鏡表征了蛋白質納米纖維的精細結構，認為蛋白質納米纖維最初形成“原纖維”即單股聚集體，然后經過螺旋纏繞逐步形成多股螺旋結構，形成成熟的納米纖維。蛋白質納米纖維具有許多特殊的物理化學特性以及生物特性，例如具有良好的表面活性和細胞穿透性，可被用于藥物載體的構建以強化細胞吸收。同時因其良好的流變特性，可用作增稠劑和凝膠填充物。蛋白質纖維聚集體具有特殊的表面活性。Mezzenga等比較了天然β-乳球蛋白及其納米纖維在油水和汽水界面的吸附和剪切流變性質，發現熱處理蛋白形成的纖維聚集體可以吸附于油水界面，其界面剪切模量明顯高于天然蛋白質。該研究還發現，未轉化成纖維聚集體的多肽的存在有可能會提高蛋白界面吸附和乳化性質。該團隊還發現，改變水相的pH值和離子強度，蛋白質纖維聚集體在油水界面具有不同的排列模式，并產生不同的界面流變特性。Gao Zhiming等也曾對蛋白質納米纖維的乳化活性做過報道。

蛋白質纖維化轉變過程較長（約4～10 h），其形成過程較為復雜。在纖維生成的不同階段，其產物的組成、結構、尺寸以及界面性質及乳化活性均不同。本實驗主要針對β-乳球蛋白在纖維形成的不同階段，研究其產物的界面及乳化活性，為其在食品工業中的合理利用提供理論依據，特別是富含蛋白質的飲料。

1材料與方法

1.1材料與試劑

食用大豆油市售；β-乳球蛋白（蛋白質干基質量分數97%，其中β-乳球蛋白占95.9%）美國Davisco食品公司；硫磺素T（thioflavin-T，ThT）、硅鎂型吸附劑/氟羅里硅土（Florisil分子篩，60～100目）美國Sigma-Aldrich公司。

1.2儀器與設備

SuperG超微量天平，芬蘭Kibron公司；Direct Q3型超純水機美國Merck Millipore公司；FE-20 FiveEasy Plus pH計梅特勒-托利多國際股份有限公司；F-7000熒光分光光度計日本日立公司；Multifuge高速冷凍離心機賽默飛世爾科技（中國）有限公司；KQ5200DE型數控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；JEM-2100（HR）透射電子顯微鏡日本電子Jeol公司；TRACKER界面流變儀，法國Teclis界面技術有限公司；PT-MR 2100型高速剪切乳化機瑞士Kinematica公司；Mastersizer 2000型激光粒度儀英國Malvern公司。

1.3方法

1.3.1蛋白質納米纖維的制備

將β-乳球蛋白分散于去離子水中（2%），室溫攪拌2 h，使其充分水化。調節蛋白質分散液pH 2.0，置于80℃水浴鍋加熱20 h，此過程持續磁力攪拌，每隔2 h定時取樣，取出后立即浸沒在冰水混合物中，冷卻20 min，隨后保存于冰箱備用。

1.3.2蛋白質納米纖維形成動力學表征

將12.0 mg ThT溶解于10 mL去離子水中，充分溶解后，用0.22μm水相濾膜過濾，于4℃冰箱中避光保存。在制備β-乳球蛋白納米纖維的過程中，取不同加熱時間樣品2.98 mL，加入20μL ThT儲藏液，均勻混合，反應1 min后進行測量。激發和發射波長分別為450 nm和482 nm，激發和發射狹縫均為5 nm，電壓為400 mV。

1.3.3透射電子顯微鏡

將β-乳球蛋白纖維分散液用pH 2.0的去離子水稀釋到質量分數為0.05%，在水浴超聲清洗裝置中以功率50%超聲處理10 min，促進樣品分散。接著，用移液槍吸取10μL樣品滴至銅網上，自然晾干，隨后用毛細管吸取2 g/100 mL的磷鎢酸（水浴超聲30 min，100%功率，且用0.22μm水相濾膜過濾）滴至樣品表層，再次晾干后進行電鏡觀察。

1.3.4界面吸附和界面流變行為分析

分別通過分析蛋白質纖維聚集體在界面吸附過程中的界面張力變化和膨脹黏彈模量的變化分析其界面吸附行為和界面流變行為。取不同階段所形成的混合分散體系稀釋至質量分數0.01%并調pH 3.5后進行界面分析，選取界面流變儀的懸滴模式檢測樣品在油-水界面上的吸附情況。量取5 mL混合分散液于樣品槽中，將U形樣品針浸入水相中，并通過馬達控制形成10μL的油滴。該實驗在室溫條件下進行，測定時間持續12 000 s，測試頻率0.05 Hz，振幅10%。在檢測過程中，整個檢測系統應保持平衡，避免外界振動干擾測量。

由于食用大豆油中含有的少量小分子表面活性成分容易對測定結果產生干擾，因此使用前需要進行純化。參考Gaonkar等[20]的方法，在100 mL食用大豆油中加入3 g Florisil分子篩吸附劑，隨后攪拌0.5 h，靜置5 min，5 000 r/min離心20 min，再加入新的吸附劑，重復上述操作3次，收集純化后的大豆油，利用界面流變儀測定去離子水的界面張力，直到其界面張力在30 min內下降不超過0.5 mN/m即可滿足要求。純化后大豆油的密度為0.914 2 g/cm3，去離子水與油相的界面張力為（27±0.1）mN/m。

1.3.5乳液制備及表征

乳液的制備：將一定量的β-乳球蛋白纖維化產物用去離子水稀釋至一定濃度，并用1 mol/L NaOH溶液調pH值至3.5，加入大豆油，配成蛋白總質量分數為0.5%，油量體積分數為10%的混合液，采用高速剪切進行乳化20 000 r/min離心2 min，乳液中添加0.4 g/L的疊氮鈉防菌。

粒徑分析：以去離子水為分散介質，采用Mastersizer 2000激光粒度儀測定乳液粒徑分布及平均粒徑。測定加樣前先將乳液輕微振蕩搖勻，再逐滴加至分散介質中，直到信號滿足測試要求。分散相和連續相的折光指數分別采用1.475和1.33，遮光度為10%～20%，樣品的吸收率為0.1%，泵轉速為2 000 r/min。每個樣品平行測量3次，取平均值。